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Méthode "coupe-insertion" - Méthode du canon à particules - Etape par étape (shémas)En introduction, il convient de rappeler les bases de la
biologie moléculaire.
Tous les organismes vivants,
végétaux ou animaux, contiennent des chromosomes qui sont les éléments du noyau de la
cellule. L'acide désoxyribonucléique (ADN) constitue ce chromosome, il est constitué
par le désoxyribose et une des quatre bases nucléiques (Adénosine, Thymine ou Uracile,
Guanine, Cytosine).
Un groupe de trois bases définit un acide aminé parmi les vingt qui composent les
protéines.
Cry 1Ab est constitué de 1821 paires de bases.
Une comparaison amusante avec l'informatique peut être faite. L'informatique est faite
de deux chiffres 0 et 1, le code génétique est fait de quatre lettres A T G C. Le
premier assemblage de 0 et 1 d'une longueur de huit caractères donne les octets; en
biologie moléculaire, le premier assemblage d'une longueur de trois caractères donne les
acides aminés. Le regroupement des octets permets d'écrire les programmes, celui des
acides aminés permet de construire les protéines.
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Le transfert génétique
proprement dit s'effectue par une méthode complexe dite de « coupe-insertion ». Des
enzymes spécialisées servent à « couper » ou exciser un gène particulier de l'ADN
d'un organisme. Ce gène est ensuite « inséré » ou épissé dans l'ADN d'un autre
organisme (voir le diagramme ci-dessous). Ce transfert d'un organisme à un autre est
réalisé grâce à diverses techniques qui dépendent des caractères et des propriétés
de l'organisme récepteur, ainsi que de la nature de ce dernier (animal, bactérie ou
plante).
Voici quelques techniques du génie génétique utilisées pour
modifier les organismes :
- Chez les animaux
On emploie
souvent la technique de « microinjection » pour obtenir des animaux transgéniques ou
génétiquement modifiés. À l'aide d'une aiguille extrêmement fine, on injecte une
solution de molécules d'ADN contenant les gènes conférant les caractères souhaités,
comme la résistance à la maladie, dans des cellules animales, habituellement
embryonnaires. Les gènes sont incorporés au génome cellulaire de l'animal, de sorte que
les cellules commencent à manifester les caractères déterminés par le nouveau gène.
Cette technique de microinjection pourrait s'avérer précieuse en agriculture.
- Chez les bactéries
Dans
certaines bactéries, on trouve de petits segments circulaires naturels d'ADN appelés
plasmides, qui peuvent servir en génie génétique. L'ADN plasmidique peut être
facilement retiré de la cellule bactérienne, modifié par l'ajout d'un nouveau gène et
réinséré dans la cellule. Équipée du nouveau gène, la cellule bactérienne peut
alors fabriquer le produit de ce gène comme si c'était le sien. Comme les bactéries se
reproduisent très rapidement, il est possible d'utiliser de fortes concentrations de
bactéries porteuses du plasmide modifié et de produire des quantités commerciales
importantes d'un produit génique, par exemple un additif alimentaire ou un vaccin pour
animaux.
- Chez les végétaux
Les
cellules végétales sont entourées d'une membrane résistante. L'insertion de matériel
génétique est donc un peu plus ardue que dans le cas des bactéries. Deux techniques
principales permettent de contrer cette difficulté.
La première repose sur une espèce bactérienne modifiée
appelée Agrobacterium. Dans la nature, Agrobacterium envahit une plante, l'infecte avec
un segment de son propre ADN qui code le développement de la tumeur du collet. Ce segment
est incorporé à l'ADN de la plante qui développe les symptômes de la maladie.
Lorsque les chercheurs utilisent Agrobacterium pour modifier
génétiquement des végétaux, ils enlèvent les segments pathogènes de l'ADN de la
cellule bactérienne. Ils appliquent la méthode « coupe-insertion » pour les remplacer
par des gènes conférant les caractères souhaités (par exemple, l'amélioration de la
valeur nutritive).
Les scientifiques introduisent ensuite Agrobacterium dans les
cellules végétales et laissent la bactérie s'y propager et y introduire le nouveau
gène. La plante formée par ces cellules végétales présente le caractère souhaité
conféré par le nouveau gène. Ainsi, Agrobacterium devient un émissaire pratique pour
transmettre aux végétaux de nouveaux caractères.
La deuxième technique d'introduction d'ADN modifié dans
les cellules végétales est celle du « canon à particules » d'ADN : de minuscules
particules métalliques enrobées des gènes souhaités, par exemple ceux qui améliorent
la valeur nutritive, sont chargées dans un canon à particules et directement injectées
par ce moyen dans les cellules végétales. Ces gènes sont incorporés à l'ADN des
cellules de la plante, qui produisent des plantes adultes possédant le nouveau
caractère.
Deux méthodes d'introduction de l'ADN dans les cellules
végétales 1. ADN conférant les nouvelles propriétés 2. Nouvel ADN coupé et inséré
dans l'ADN plasmidique circulaire de la cellule d'agrobacterium. (2) Minuscules particules
métalliques enrobées du nouvel ADN 3. Agrobacterium transfère le plasmide dans les
cellules végétales. (3) Les particules sont placées dans un « canon à particules »
4. Le nouvel ADN est incorporé aux chromosomes de la plante. 5. Les cellules végétales
munies du nouvel ADN se divisent. 6. Les cellules végétales donnent des plantules ayant
les nouveaux caractères dans un plat de Pétri. 7. Les plantules sont ensuite
transférées en terre.
Fabrication
du gène chimère.
1ère étape :
Extraction du gène (schéma 1)
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- Le plasmide (chromosome)
est extrait de Bacillus Thuringiensys Bt
- Des enzymes de restriction; coupe
en amont et en aval du gène d'intérêt en laissant autour du gène une bordure et le
promoteur et le terminateur du donneur.
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2ème étape : Élimination du
promoteur et terminateur du donneur.
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- Le promoteur et terminateur du gène sont
plus ou moins spécifiques de la plante ou de l'organisme. Ils servent à l'expression du
gène. Les promoteurs de Bt ne permettraient pas l'expression du gène dans le maïs.
Aussi, il faut les retirer avec de nouveaux enzymes de restriction. (schem)a2
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3ème étape : Reconstruction
du gène.
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- Il faut permettre l'expression du gène en
"recollant" à notre gène d'intérêt un promoteur et un terminateur qui
permettront l'expression du gène dans la plante maïs.
- Parallèlement un deuxième gène
est préparé qui donnera à la plante une tolérance ou une résistance à un herbicide.
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4ème étape : Multiplication du gène
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- Le ou les gènes qui ont été obtenus
doivent être multipliés avant d'être utilisés. Escherichia Coli qui est une bactérie
de clonage, va réaliser cette multiplication.
- Le plasmide de Escherichia Coli est
extrait de la cellule, il a été modifié auparavant avec un marqueur antibiotique qui
servira à éliminer les bactéries non transformées dans le processus de multiplication.
- Le plasmide est coupé pour y
introduire le ou les gènes d'intérêts
- Le plasmide est réintroduit dans
Escherichia Coli qui, en se multipliant, reproduira les gènes.
- A l'issue de cette multiplication,
les plasmides recombinants qui n'ont pas été transformés sont éliminés avec
l'antibiotique ampicilline.
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Insertion
des plasmides dans la plante.
5ème Étape :
La biolistique
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- Plusieurs méthodes de réintroduction des
séquences de gènes existent, l'une d'elle est la biolistique. Des micro billes de
tungstène sont enduites des plasmides extraits des bactéries.
- Un canon à particules
"tire" ce mélange sur des plantules ou cales.
- Les plantes ainsi blessées
vont introduire dans leur patrimoine génétique les séquences de gènes.
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6ème Étape :
Régénération de la plante transformée
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- Dans des boites de Pétri les plantules
sont régénérées.
- Les plantes qui ne sont pas
tolérantes à l'herbicide sont éliminées à ce stade.
- La plante ainsi obtenue porte le ou
les gènes d'intérêt.
- Il est vérifié, par la suite,
l'expression du gène dans la plante, ainsi que sa stabilité dans le temps.
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